Fue criada en Flandes, junto a su hermano Carlos y sus hermanas Isabel y María, y educada por su tía Margarita, una de las princesas más cultas de la Europa Renacentista.

Siendo todavía una niña, y destacando ya en ella una extraordinaria belleza y sensibilidad por todas las artes, su abuelo paterno, el emperador Maximiliano I de Habsburgo, trata de desposarla con Enrique, príncipe de Gales, que luego sería el sanguinario Enrique VIII, el cual acabaría contrayendo matrimonio con la hija pequeña de Isabel y Fernando, y por lo tanto tía de Leonor, Catalina,  también de triste destino.

Ella, aunque sabedora de cuál era su sino, que no era otro que servir a la política de procurar matrimonios ventajosos para su familia, para su dinastía, no puede evitar enamorarse de Federico II, conde palatino de Rin. Pero aquel romance se fue al traste al caer, por una indiscreción, en las manos de su hermano Carlos una carta que acreditaba el idilio.Tras el descubrimiento, el futuro emperador obliga a los enamorados a jurar que no se habían casado en secreto, y expulsa al conde de la Corte. Dicen que para que Leonor olvidará a Federico, se la incluye en el primer viaje de Carlos a España, que la lleva a visitar Llanes en septiembre de 1517.

Al poco tiempo de su llegada a Castilla, la comprometen con el rey  Manuel de Portugal, que era viudo de sus  dos tías, Isabel y María, hijas de los Reyes Católicos. La boda se celebra en Lisboa el 7 de marzo de 1519, ella tenía 20 años y el 50. 

De aquel matrimonio, de simple conveniencia, nacen dos hijos, Carlos, que muere al año de vida, y María, a la que Leonor debe abandonar, con apenas 2 años, cuando fallece su esposo víctima de la peste. Viuda con 23 años, y dejando su dote integra a su hija para asegurar su futuro, retorna al lado de su hermano.

Deshecha, por tener que separarse de su pequeña María, empieza su segundo calvario a causa de que Carlos I de España y V de Alemania andaba enzarzado en una lucha de poder con el principal de sus adversarios, el rey francés Francisco I, al que consigue finalmente derrotar. Entre las numerosas condiciones impuestas al perdedor en el Tratado de Madrid, figura la de casarse con la hermana del vencedor. La boda tuvo lugar  en Illescas (Toledo), aunque el francés no reconoce  a Leonor como su esposa hasta la firma del Tratado de las Damas, formalizado casi cuatro años más tarde. Y, ahí, tenemos a Leonor, reina viuda de Portugal, camino de Francia

Este otro sacrificio también fue inútil, ya que las relaciones de su hermano con su esposo no mejoraron, y ella en aquella refinada y lujuriosa Corte tuvo que soportar el rechazo y el desprecio, y como el rey desviaba sus atenciones hacia otras mujeres.

En 1547, después de diecisiete años de humillaciones y con la salud frágil, muere Francisco, y con el título de duquesa de Turena, que recibe a modo de dote, Leonor, doblemente reina y doblemente viuda, regresa junto a su  querido hermano. Desde ese momento, dedica todas sus fuerzas, ayudada por Carlos, a conseguir el consentimiento del rey de Portugal para que su hija María viva con ella. 

Tras la abdicación de Carlos V y su retiro a Yuste, al que acompañan tanto Leonor como su hermana  María, contra todo pronóstico y de forma totalmente inesperada su primo el rey Juan III de Portugal accede a  que la infanta María se reúna con su madre. Sin embargo, los años de separación, que no habían pasado en balde, dan lugar a que la infanta portuguesa, que nunca llegó a perdonar el abandono de su madre, se niegue a permanecer junto a su progenitora, y vuelve a Portugal. 

Ese fue el golpe de gracia para Leonor, que fallece el 18 de febrero de 1558 en Talavera la Real y es enterrada en la catedral de Mérida, hasta que su hermano Carlos ordena que se trasladen sus restos al Monasterio de Yuste. 

Actualmente, reposa en el Panteón de Infantes del Monasterio del Escorial.

Es curioso que si de aquellas en la sucesión al trono no hubiera regido la preferencia del varón a la mujer, Leonor de Austria hubiera sido, como primogénita, también Princesa de Asturias.